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更新時間：2021-01-08 
瀏覽次數：3856實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。
根據 PCR 定量原理公式可推導出， 模板起始拷貝數的對數與閾值循環(huán)數呈線性關系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數量呈對應關系， 只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環(huán)數。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻重現性。
模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標記方法
方法 | 優(yōu)點 | 缺點 | 應用范圍 |
SYBR Green I | 適用性廣 靈敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出現非特異條帶 | 科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物研究 |
Taqman | 特異性高 重復性好 | 價格高 只適合特定目標 | 病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
分子信標 | 高特異性 熒光背景低 | 只適合特定目標 設計困難 價格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
熒光定量 PCR 反應體系舉例 | |
試劑 | 含量 |
2xGoTaq Master Mix | 5µl |
無核酸酶水 | 3.5µl |
上游引物 | 0.25µl |
下游引物 | 0.25µl |
基因組 DNA | 1µl（約20ng）梯度稀釋 |
共 10µl | |
儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構。
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